그람염색법 자료
분별염색은 열고정된 도말 표본에 적어도 세 가지 이상의 염색시약을 사용하여 이루어 진다. 먼저 1차 염색시약으로 균체를 염색하고 2차 염색시약과의 대비를 보이기 위해 탈색제를 쓴다. 이때 세포구조물질의 성질차이에 의해 1차 염색시약이 제거되기도 하고 되지 않기도 한다. 그리고 2차 염색시약 혹은 대응 염색시약으로 염색하여 1차 염색시약과 대비되는 색을 나타낸다. 즉 1차 염색 후 탈색 된 균체는 2차 염색시약에 의해 염색이 되지만 탈색되지 않는 균체는 2차 염색시약을 흡착하지 못하고 그대로 1차 염색시약의 색깔을 유지하게 된다. 이러한 분별염색을 세균에 응용한 가장 중요한 염색법이 그람염색인데 이는 1884년 Christian Gram에 의해 고안되어 명명되었다. 이는 세균 세포벽의 성분조성에 따라 그람 양성균과 음성균으로 나누어지고 그람 양성균에는 대부분의 구균과 유포자 간균이, 그람음성균에는 대부분의 간균이 속하고 있다.
그람염색에는 4가지 시약이 사용되고 그 원리는 다음과 같다. 먼저 1차 염색시약으로 Crystal violet의 염기성 시약을 사용하면 이에 의해서 모든 세포는 보라색으로 염색된다. 그 다음 Crystal violet 시약을 세포에 강하게 고정시키기 위해 매염제로 Gram`s iodine 시약을 사용한다. 이는 1차 염색시약과 결합하여 불용성 화합물인 Crystal violet-iodine(CVI) complex를 형성하여 세포에 더욱 강하게 고정시키며 모든 세포는 짙은 자줏빛을 띠게 된다. 특히 그람 양성균은 세포벽 중의 Magnesium-ribonucleic acid가 CVI complex와 결합하여 Mg-RNA-CVI complex가 형성되는데 이것은 CVI complex보다 세포에 더욱 강하게 결합되어 제거하기가 더욱 어렵다. 여기에 탈색제로 지방용해와 단백질 탈수작용이 있는 95% 에탈 알코올을 사용하여 탈색시킨다. 이는 세포벽중의 지방 함유량이 높은 그람 음성균은 지방이 알코올에 녹아 세포벽에 큰 구멍이 생기고 세포벽 단백질의 탈수가 어느 정도 진행된다.
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