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Intro ......

 

PCR product, pGEM-T or pGEM-T Easy Vector (50 ng), dCTP, buffer PB,, primer, DNA polymerase & Buffer, pGEM-T Easy Vector (50 ng) - 1 ㎕,그런 후 4℃에서 보관한다. 원심분리 후에는 필터링 된 물질을 제거한다. Methods 1) 형광 발현 유전자를 PCR로 cloning한다.유전공학 실험 - PCR과 Transformation 업로드 ???? 파일문서 (압축파일). ① 튜브에 DNA template 1㎕, buffer NW, buffer들이 있는 PCR tube에 옮겨 담은 다음 잘 섞이도록 pipetting을 해준다. Introduction 유전자를 cloning하여 vector에 주입하여 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다. 2) PCR산물을 분리, dTTP), column, 정제한다.hwp 유전공학 실험 - PCR과 Transformation. ⑥ 2㎕을 전기영동한다. ▶ cycle이나 온도, PCR tube, 58℃에서 30초, micro pipette, DW, 2X Rapid Ligation Buffer, dNTPs (dATP, 시간의 설정은 충분히 primer가 붙을 수 있도록 설정한다.hwp.hwp 유전공학 실험 - PCR과 Transformation.hwp  ......

 

 

Index & Contents

유전공학 실험 - PCR과 Transformation 업로드

 

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PCR과 Transformation

실험 일시 :

 

1. Introduction

유전자를 cloning하여 vector에 주입하여 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다.

 

2. Materials

DNA template, primer, DW, DNA polymerase & Buffer, dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), PCR tube, micro pipette, column, buffer PB, buffer NW, buffer EB, T vector, 2X Rapid Ligation Buffer, pGEM-T or pGEM-T Easy Vector (50 ng), PCR product, T4 DNA Ligase, gel, 도말 plate, 따뜻한 물, shaking machine

3. Methods

1) 형광 발현 유전자를 PCR로 cloning한다.

① 튜브에 DNA template 1㎕, FW primer 2㎕, RV primer 2㎕, DW 15㎕를 넣으려고 하였으나 실패의 가능성이 있으므로 각각 2배의 양으로 한다.

② 그 다음 polymerase, buffer들이 있는 PCR tube에 옮겨 담은 다음 잘 섞이도록 pipetting을 해준다. PCR tube에는 라벨링을 한다.

▶ PCR tube 속에 있는 파란 물질은 염색을 하기 위한 용도로 전기영동 시에 홈에 주입하였는지 확인을 더 쉽게 할 수 있다.

③ 94℃에서 2분 동안 진행하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 한 cycle을 설정하여 35cycle을 진행한다. 그런 후 4℃에서 보관한다.

▶ cycle이나 온도, 시간의 설정은 충분히 primer가 붙을 수 있도록 설정한다.

④ 2㎕을 전기영동한다.

2) PCR산물을 분리, 정제한다.

① PCR산물의 볼륨의 5배에 해당하는 양의 buffer PB를 넣은 후에 준비된 column에 모두 옮겨 담고 30초 동안 원심분리 한다.

② 아래쪽에 필터링 된 물질을 pipette으로 제거한 후 buffer NW를 700㎕ 추가한 후에 30초 동안 원심분리 한다. 원심분리 후에는 필터링 된 물질을 제거한다.

③ 1분 동안 추가적으로 원심분리를 하고난 후에 새로운 1.5ml tube로 column을 옮긴다.

④ 30㎕의 buffer EB를 넣고 1분 동안 원심분리를 한다.

⑤ 1.5ml tube에 있는 물질이 정제된 PCR산물.

⑥ 2㎕을 전기영동한다.

3) 2X Rapid Ligation Buffer - 5 ㎕, pGEM-T Easy Vector (50 ng) - 1 ㎕, PCR product - 3 ㎕, T4 DNA Ligase - 1 ㎕로 총 10㎕를 튜브에 넣고 이 튜브를 1시간 동안 실온에 보관한다.

4) 칼슘을 처리한 박테리아가 해동될 때 까지 얼음에 보관하고 이후 조심스럽게 세포를 반응 튜브 안으로 주입한다.

5) 튜브를 얼음에 30초 동안 보관한다,

6) 42℃의 물에 90초 동안 놔두었다가 …(생략)

 

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